Mit Rileys Geburt wird gleichzeitig ihre Emotionszentrale gestartet. Freude, ihre erste Emotion, betritt den Kontrollraum und erblickt Rileys Eltern, die von Riley angelächelt werden. Die erste positive Erinnerung wird abgespeichert, jedoch taucht kurz darauf Kummer auf, woraufhin Riley anfängt zu schreien.
Rileys Kindheit wird fortan von fünf Emotionen geprägt: Freude, Kummer, Angst, Wut und Ekel. Zusammen führen sie Riley durch den Alltag. Die Erinnerungen werden einer Emotion zugeordnet und am Ende des Tages über eine Rohrpost in das Langzeitgedächtnis befördert. Einige zentrale, positive Erlebnisse werden im Kontrollraum aufbewahrt. Jedes dieser Kernerlebnisse erzeugt eine Erinnerungsinsel, aus denen sich Rileys Persönlichkeit zusammensetzt („Familie“, „Ehrlichkeit“, „Eishockey“, „Quatsch machen“ und „Freundschaft“).
Als Riley elf Jahre alt ist, zieht sie mit ihren Eltern nach San Francisco. Es stellt sich heraus, dass der Umzugswagen nicht rechtzeitig eintrifft, sodass sich die Familie provisorisch einrichten muss. Freude versucht, die angespannte Situation ins Positive zu retten, jedoch gerät die Lage an Rileys erstem Tag in der neuen Schule außer Kontrolle: Riley soll sich vorstellen und bricht in Tränen aus. Kummer kann nicht mehr an sich halten und berührt die Kernerlebnisse. Freude versucht, die Kernerlebnisse zu retten, wobei diese mit der Luftpost zusammen mit Freude und Kummer in das Langzeitgedächtnis befördert werden.
Da Riley ohne Freude und ihre Kernerlebnisse verloren ist, müssen Freude und Kummer schnellstens zurückfinden. Auf ihrem abenteuerlichen Trip treffen sie auf Bing Bong, Rileys Fantasiefreund aus Kindertagen. Er schlägt vor, den Gedankenzug zu nehmen, allerdings bleibt dieser stehen, als die Nacht über sie hereinbricht. Um Riley zum Aufwachen zu bewegen, begeben sie sich in die Traumstudios, in der gerade Rileys desaströser, erster Schultag gedreht wird. Freude und Kummer platzen in die Aufnahme, wodurch ein Chaos entsteht. Bing Bong wird als Unruhestifter verhaftet und ins Unterbewusstsein gebracht. Bei seiner Befreiung locken Freude und Kummer den überlebensgroßen Kindergeburtstags-Clown Jangles in das Filmstudio, wodurch Riley schließlich aufwacht.
Währenddessen beraten die verbleibenden Emotionen in der Kommandozentrale, wie es ohne Freude und die Kernerlebnisse weitergehen soll; drei der fünf Erinnerungsinseln sind bereits abgestürzt. Wut schlägt vor, wegzulaufen und in Minnesota neue positive Erlebnisse zu sammeln. Er bringt Riley auf den Plan und damit die letzten verbleibenden Erinnerungsinseln, die Ehrlichkeits- und die Familieninsel, ins Wanken. Als letztere abstürzt, reißt sie die Gleise des Gedankenzugs mit sich, sodass Freude, Kummer und Bing Bong wieder im Langzeitgedächtnis landen. Freude versucht, über die Luftpost zurückzukehren, allerdings wird diese zerstört, als weitere Teile abstürzen. Freude und Bing Bong fallen in den Abgrund, in dem Erinnerungen entsorgt werden. Die Lage ist scheinbar ausweglos.
Freude erinnert sich jedoch, dass zuvor auch Bing Bongs Raketenwagen entsorgt wurde. Mit ihm gelingt es ihr, aus dem Abgrund zu entkommen, während Bing Bong zurückbleibt und allmählich verblasst. Freude sucht Kummer, die sich in Trübsal verliert, und kann schließlich mit einem Trampolin wieder in die Kommandozentrale zurückkehren. Ihr ist klar geworden, dass Riley ohne Kummer nicht fröhlich sein kann, sodass sie ihr das Schaltpult überlässt. So gelangt Riley, die inzwischen im Bus nach Minnesota sitzt, im letzten Moment zur Einsicht. Sie läuft nach Hause, wo sie sich mit ihren Eltern versöhnt. Durch das Zusammenspiel von Freude und Kummer entsteht eine neue Kernerinnerung, die beide Emotionen verbindet. Von nun teilen die Emotionen eine Erinnerung. Zudem wird ein neues Schaltpult installiert, das unter anderem den Alarmschalter „Pubertät“ enthält.
